SP三步法操作步驟

操作步驟：

、脫蠟：60℃ 20min；二甲苯I0min 、二甲苯II0min。

2、梯度酒精脫水：00%EtOH I 5min 、00%EtOH II 5min、95%EtOH 3min、80% EtOH 3min、70% EtOH 3min。抗體(ti)

3、滅活內(nei) 源性過氧化物酶：3%H2O2 常溫下避光孵育0min，PBS衝(chong) 洗3次×3min；

4、抗原修複：置0.0M枸櫞酸緩衝(chong) 液（PH 6.0）中用煮沸（微波爐可高火4次×6min），自然冷卻30min 以上，至室溫後PBS衝(chong) 洗3次×3min。

5、封閉：用封閉液（一般與(yu) 二抗來源一致，如正常羊血清工作液）封閉，常溫下0~30min，傾(qing) 去勿洗。

6、一抗孵育：滴加適宜濃度的一抗4℃ 冰箱孵育過夜（zui常用），37℃複溫45min，PBS衝(chong) 洗5次×3min（用PBS緩衝(chong) 液代替一抗作陰性對照）；

7、二抗孵育：滴加標記二抗，37℃孵育30min, PBS衝(chong) 洗5次×3min；

8、SP反應：滴加辣根過氧化物酶標記的鏈黴親(qin) 和素工作液，37℃孵育30min，PBS衝(chong) 洗5次×3min；

9、DAB顯色：配置DAB/H2O2反應液孵育組織切片，鏡下控製染色，一般3~0min，自來水充分衝(chong) 洗；

0、蘇木素複染：一般胞漿蛋白或胞膜蛋白可以適當染至幾十秒~幾分鍾，但細胞核蛋白在幾秒。若過染，可以用%HCl褪色；抗體(ti)

、常規脫水：50% ethanol -2min、70% ethanol -2min、95% ethanol -2min、95% ethanol -2min、00% absolute ethanol: （-2）min、00% absolute ethanol: （-2）min；

2、透明：Xylene ×（-2）min→Xylene 2×（-2）min；

3、封片：中性樹膠。

注意事項

、蘇木素複染時間需要摸索，尤其陽性染色也在細胞核上。

2、DAB顯色時間需要達到*化，鏡下觀察達到陽性染色明顯但背景不太深。

3、抗體(ti) 孵育時間和抗體(ti) 濃度需要摸索。尤其一抗孵育在4度過夜。

4、切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩幹洗滌液，但又防止幹片；用組化筆畫圈時盡量畫大一點，否則墨水排斥液體(ti) ，引起片周邊幹片。