免疫印跡的檢查過程

檢查過程

() 蛋白質樣品獲得：細菌誘導表達後，可通過電泳上樣緩衝(chong) 液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩衝(chong) 液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-min。然後4℃，3,000g離心5min。取上清液作為(wei) 樣品。

(2) 電泳：製備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。　

(3) 轉移：(半幹式轉移)

① 電泳結束後將膠條割至合適大小，用轉膜緩衝(chong) 液平衡，5min×3次。

② 膜處理：預先裁好與(yu) 膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩衝(chong) 液中0min。

③ 轉膜：轉膜裝置從(cong) 下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多餘(yu) 的液體(ti) 吸幹。接通電源,恒流mA/cm2，轉移.5hr。轉移結束後，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s後，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然後用雙蒸水洗，風幹夾於(yu) 兩(liang) 層濾紙中保存，留與(yu) 顯色結果作對比。

(4) 免疫反應：　

① 用0.0M PBS洗膜，5min ×3次。

② 加入包被液，平穩搖動，室溫2hr。　細胞

③ 棄包被液，用0.0M PBS洗膜，5min×3次。　

④ 加入一抗(按合適稀釋比例用0.0M PBS稀釋，液體(ti) 必須覆蓋膜的全部)，4℃ 放置2hr以上。陰性對照，以%BSA取代一抗，其餘(yu) 步驟與(yu) 實驗組相同。　

⑤ 棄一抗和%BSA，用0.0M PBS分別洗膜，5min×4次。　

⑥ 加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(按合適稀釋比例用0.0M PBS稀釋)，平穩搖動，室溫2hr。　

⑦ 棄二抗，用0.0M PBS洗膜，5min×4次。　

8、加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。細胞