革蘭氏染色的操作方法

方法概述 　　

    革蘭(lan) 氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，884年由丹麥醫師、細菌學家 Christain Gram創立。 細胞　　

    為(wei) 觀察方便，脫色後再用一種紅色染料如堿性蕃紅、稀釋複紅等進行複染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的杆菌和絕大多數的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭(lan) 氏正反應；弧菌，螺旋體(ti) 和大多數致病性的無芽胞杆菌都呈現負反應。革蘭(lan) 氏陽性菌對敏感，革蘭(lan) 氏陰性菌對敏感。可根據革蘭(lan) 氏染色法鑒別不同菌種並對症下藥。 　　 

    革蘭(lan) 氏陽性菌和革蘭(lan) 氏陰性菌在化學組成和生理性質上有很多差別，染色反應不一樣。現在一般認為(wei) 革蘭(lan) 氏陽性菌體(ti) 內(nei) 含有特殊的核蛋白質鎂鹽與(yu) 多糖的複合物，它與(yu) 碘和結晶紫的複合物結合很牢，不易脫色，陰性菌複合物結合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應的主要依據。 另外，陽性菌菌體(ti) 等電點較陰性菌為(wei) 低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴(yan) 格控製。例如，在強堿的條件下進行染色，兩(liang) 類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應；PH很低時，則可都呈負反應。此外，兩(liang) 類菌的細胞壁等對結晶紫—碘複合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應嚴(yan) 格控製。

染色原理 　　

    G﹢菌：細胞壁厚，肽聚糖網狀分子形成一種透性障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結晶紫-碘複合物在細胞膜上。呈紫色。 　　

    Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯鬆散，乙醇脫色不能使其結構收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫-碘複合物溶出細胞壁，番紅染液複染後呈紅色。

操作流程 　　

    革蘭(lan) 氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、複染等四個(ge) 步驟，具體(ti) 操作方法是： 　　

（）載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌於(yu) 幹淨的載玻片上塗布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定。 　　

（2）草酸銨結晶紫染分鍾。 　　

（3）自來水衝(chong) 洗，去掉浮色。 　　

（4) 用碘-溶液媒染分鍾，傾(qing) 去多餘(yu) 溶液。 　　

（5）用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭(lan) 氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭(lan) 氏陰性菌被褪色而呈無色。 細胞　　

（6）用蕃紅染液複染30秒，革蘭(lan) 氏陽性菌仍呈紫色，革蘭(lan) 氏陰性菌則呈現紅色。革蘭(lan) 氏陽性菌和革蘭(lan) 氏陰性菌即被區別開。