檢測抗原特異性IgE抗體的方法

有兩(liang) 種方法用來檢測抗原特異性IgE抗體(ti) ：（）IgE抗體(ti) 檢測，前麵稱為(wei) 放射免疫吸附試驗（2）淋巴細胞組胺釋放試驗。描述淋巴細胞組胺釋放試驗是在50多年以前，隨後它被改進和自動化。22-25先用葡聚糖沉澱法分離外周血淋巴細胞，洗滌，用含鈣和鎂離子的緩衝(chong) 液懸浮。往洗滌過的固定量的淋巴細胞中，加入不同濃度的變應原提取物，混合物在37℃孵育一小時。4℃冷卻試管以終止反應，通過離心分離細胞。變應原與(yu) 結合在細胞上的IgE抗體(ti) 發生反應後，嗜堿細胞釋放組胺至上清液，先用丁烷再用酸提取組胺。可用熒光分光光度計或RIA方法檢測提取物中的組胺濃度。26.27手工操作的熒光分光光度計法，可檢測大約ng的組胺。RIA法更敏感。用細胞釋放的組胺占組胺總濃度的百分比來表示結果，將未接觸過變應原提取物的淋巴細胞溶於(yu) 高氯酸，然後在該細胞溶解產(chan) 物中檢測組胺的總濃度。

淋巴細胞組胺釋放試驗詳細說明了結合在細胞上的IgE抗體(ti) 的特異性，也表明了釋放介導因子的機製在功能上的完整。大約5%的個(ge) 體(ti) ，他們(men) 的淋巴細胞在體(ti) 內(nei) 不釋放組胺。28盡管已發展了自動化係統來檢測組胺，但組胺釋放試驗的臨(lin) 床應用仍然有限，因為(wei) 它要求使用新鮮血液，而且，僅(jin) 單獨使用血液的一部份就能檢測出的變應原也很有限。29還有，用這些方法測定組胺時，存在相當大的室內(nei) 實驗室差異。

IgE抗體(ti) 檢測是一個(ge) 雙位點IMA。3該方法的*階段：IgE抗體(ti) 待測的血清標本與(yu) 固相結合的變應原免疫吸附劑反應。第二階段：2-4小時後，衝(chong) 掉沒有抗體(ti) 的血清部份，變應原與(yu) 放射性標記或酶標，及經親(qin) 和力層析法純化的抗體(ti) 或單克隆抗-IgE抗體(ti) 一起孵育。第二階段的抗-IgE抗體(ti) 與(yu) 變應原免疫吸附劑的結合，可以檢測在*階段被結合的抗體(ti) 。

IgE抗體(ti) 檢測並沒有測出IgE抗體(ti) 的實際濃度。許多過敏性個(ge) 體(ti) 的血清，含的抗體(ti) 濃度都超過變應原免疫吸附劑的結合能力，因而*階段孵育的上清液中，含有過剩的IgE抗體(ti) 。32而且，由於(yu) 大多數變應原都是複雜的蛋白質或糖化蛋白，所以，各血清包含的是能以不同的親(qin) 和力與(yu) 變應原反應的抗體(ti) 混合物。而且，在一限定的範圍，第二階段抗體(ti) 的結合與(yu) 血清裏的IgE抗體(ti) 濃度成比例。這層關(guan) 係已在用校正的標準曲線定量測定IgE抗體(ti) 的研究應用中被用到。33.34然而，由於(yu) 常規的IgE抗體(ti) 檢測，IgE抗體(ti) 通常都過量，第二階段抗體(ti) 的結合不僅(jin) 反映了待測抗體(ti) 的量，還反映了它的親(qin) 和力，因此，結果是半定量的。

正如前麵Wide等人3描述的那樣，IgE抗體(ti) 檢測使用了與(yu) 交聯匍聚糖珠粒共價(jia) 結合的變應原。隨後人們(men) 又使用了各種別的固相材料，34.35包括纖維素載體(ti) ，微晶纖維素顆粒，瓊脂糖珠子，濾紙，多聚乙烯小杯或微量滴定孔。這些固相材料大多都是帶有遊離氫氧根的多醣類，該氫氧根能與(yu) 溴化氰反應形成穩定的咪多卡中間物。36後者與(yu) 蛋白質變應原的氨基部份反應形成共價(jia) 鍵。與(yu) 多聚乙烯孔或小杯的結合是非共價(jia) 吸附。臨(lin) 床實驗用時，變應原免疫吸附應該含有原始變應原提取物的所有免疫源性成份，並且與(yu) 複雜的變應原具相同比例。雖然監測蛋白質與(yu) 固相發生化學結合，相對來說比較容易，但在不同的變應原係統，很少有這樣一些數據提供，即能夠表明所有的相關(guan) 變應原都被結合上了。Alternaria變應原已被具體(ti) 地研究過，吸附研究表明，所有相關(guan) 的免疫源性成份都被結合到了固相免疫吸附劑上。用固相免疫吸附劑吸附0個(ge) Alternaria過敏病人的血清，該血清池的皮膚致敏活性將喪(sang) 失。37確保所有相關(guan) 變應原都與(yu) 固相免疫吸附劑結合上的另一方法就是，用含變應原的溶液與(yu) 化學活化的微粒子免疫吸附劑結合。38衝(chong) 洗，懸浮吸附試劑，從(cong) 對還在疑問當中的變應原過敏的幾個(ge) 個(ge) 體(ti) 中得到血清，然後用這些不同量的血清來檢測，從(cong) 而得到一係列劑量反應曲線。當所有的變應原都固相免疫吸附劑結合後，劑量反應曲線變平。這點之前製備的各免疫吸附劑搭配後產(chan) 生zui終的固相免疫吸附劑。

如前所述，商業(ye) 上已提供了好幾種類型的變應原免疫吸附劑。商業(ye) 提供的zui普遍的是使用纖維載體(ti) 或免疫吸附盤，但小杯型的免疫吸附劑如微量滴定孔，也有提供。無論使用哪一型試劑，在技術上都很方便。因為(wei) 在測定過程中，不需要離心。試劑一旦配置好，都很穩定。

IgE抗體(ti) 檢測的分析靈敏度部份是由第二階段使用的標記的抗-IgE抗體(ti) 決(jue) 定。商業(ye) 上放射性標記、親(qin) 和力層析純化的抗-IgE抗體(ti) 作為(wei) 蛋白質的檢測，效果很好，可以定量檢測ng的IgE抗體(ti) 。39為(wei) 了循環使用放射性標記的抗-IgE抗體(ti) ，商業(ye) 製造商已發展了使用酶連抗體(ti) 的免疫方法。這些方法的分析特征跟舊的RIA方法相似。放射性標記的單克隆抗體(ti) 在商業(ye) 上也有提供。

幾乎所有的常見變應原（包括動物上皮細胞，食物，黴菌，塵，昆蟲毒液，一些藥物，以及牧草、野草和樹木的花粉）都被提供用於(yu) IgE抗體(ti) 的檢測。大多數藥物都低分子量的複合物，沒有遊離的氨基部份，不會(hui) 與(yu) 溴化氰活化的固相起反應。然而，有些低分子量的藥物，如胰島素，卻能與(yu) 之結合並製成令人滿意的免疫吸附劑。至於(yu) ，Penicilloyl可以與(yu) Polylysine或蛋白質載體(ti) 結合，後者又可與(yu) 活化的固相結合，以用於(yu) IgE抗體(ti) 的檢測。40還沒提供有類似的試劑，用於(yu) 檢測這類IgE抗體(ti) 的檢測，即抗所謂的微量抗原性決(jue) 定物，該物質可能與(yu) 一些急性過敏反應有關(guan) 。

如更前麵所談到的，IgE抗體(ti) 檢測不是定量的免疫測定，結果的描述也很複雜，因為(wei) 有好幾種公式可以用來給結果記分和報告結果。大多數商業(ye) 上提供的、以結果的得分情況為(wei) 根據的方法，都是以與(yu) 病人劑量反應曲線數據做對比為(wei) 根據。兩(liang) 種方法zui常用：把一係列陽性質控物的稀釋液與(yu) 變應原免疫吸附劑一起孵育，得到參考曲線；或用結合抗-IgE抗體(ti) 的免疫吸附劑去捕獲標準液中的IgE，該標準液中一已知量的IgE蛋白質。（如25U/ml）。無論哪一種情況，都要定義(yi) 一個(ge) 閾值，用來表示IgE與(yu) 固相的非特異性結合（陰性）和gE與(yu) 免疫吸附劑的變應原特異性結合（陽性）之間的臨(lin) 界值。定量表示結果可以用單位/毫升，半定量表示是從(cong) 0級（陰性）- 6級（強陽性），或用比率來表示：待測血清的結合跟同一方法檢測到的非過敏個(ge) 體(ti) 血清池的結合相比。理論上，zui後這種方法比較合適，因為(wei) 不可能假設每一個(ge) 抗體(ti) -變應原係統都產(chan) 生相同的劑量反應曲線。

除了隨機誤差，還有別的原因導致IgE抗體(ti) 檢測的結果有誤。IgE蛋白質水平增高的血清和許多變應原免疫吸附劑一起檢測的時候，由於(yu) 非特異性結合的增加，血清會(hui) 產(chan) 生臨(lin) 界或弱陽性結果。IgE濃度低於(yu) 000 U/ml時不會(hui) 出現這種現象，除非把陰性和陽性的分界點設在很低的水平。42由於(yu) IgG抗體(ti) 對IgE抗體(ti) 結合的抑製，可能出現假陰性結果。43IgG抗體(ti) 的親(qin) 和力與(yu) IgE抗體(ti) 相似，而且，在免疫治療中的病人身上，通常以ng/ml的濃度出現。44IgE抗體(ti) 的檢測，對判定已接受治療的病人身上是否還有臨(lin) 床過敏性存在作用不大，在未接受過治療的病人身上，很少發現有高水平的IgG抗體(ti) 。

由於(yu) 沒有*可靠的參考方法來定義(yi) 一個(ge) 變應原的敏感性，所以很難定義(yi) IgE抗體(ti) 的診斷靈敏度和特異性。但很多的臨(lin) 床研究，都把IgG抗體(ti) 檢測的結果與(yu) 體(ti) 內(nei) 診斷試驗（皮膚測試，吸入抗原或兩(liang) 者）和過敏性疾病家族史做對比。從(cong) 這些研究中可以很清楚地看到：由於(yu) 接觸抗原與(yu) 檢測的間隔時間不同、變應原種類不同、病人年齡以及受影響的靶器官不同，使得診斷靈敏度有相當大的變化。更重要的是，IgG抗體(ti) 檢測的敏感性與(yu) 臨(lin) 床敏感性成正比。不考慮變應原或過敏性疾病，對變應原顯著過敏的個(ge) 體(ti) ，IgG抗體(ti) 檢測的結果可能為(wei) 陽性，而在具輕微過敏性的個(ge) 體(ti) 中可能為(wei) 陰性。

在不同的變應原係統中，許多研究都支持這樣一個(ge) 結論：對變應原具有輕微過敏的個(ge) 體(ti) ，皮膚試驗比IgE抗體(ti) 檢測更敏感。然而，也有許多類似的研究表明，用陽性內(nei) 髒激發試驗，皮膚測試裏很大一部份的弱陽性不能被確認。這種討論有點不切實際：對變應原顯著過敏的病人，無論皮試還是IgE抗體(ti) 實驗，都很可靠，而對輕微程度的臨(lin) 床過敏，兩(liang) 者都不是*可靠。

與(yu) 皮試相比，檢測IgE抗體(ti) 有一定的優(you) 勢：它方便；對病人沒有危險；結果不受藥物治療的影響。除此之外，對某些群體(ti) 的病人，更應使用IgE抗體(ti) 檢測而不是皮試：如嬰幼兒(er) 、皮膚劃紋症病人或全身性皮膚炎病人。IgE抗體(ti) 檢測也有不足：血清學實驗比皮試昂貴而敏感性卻不如它，且不能立即出結果。
皮試可用多種變應原，與(yu) 此相比，多種IgE抗體(ti) 的檢測,所需要的花費卻限製了它作為(wei) 過敏性疾病篩選的用途。近年，人們(men) 通過改進IgE抗體(ti) 的測定方法，發展了多變應原IgE抗體(ti) 檢測，它可能更有效。多變應原IgE抗體(ti) 檢測是在同一試管中，加入多種變應原的免疫吸附劑，或使用已結合多種變應原的吸附劑。多變應原方法分析的敏感性可與(yu) 單變應原方法相比。對鑒別吸入性變應原導致呼吸道變態反應的孩子，多變應原方法的診斷敏感性比IgE抗體(ti) 檢測更高，46 當然，要證明該實驗篩選過敏性疾病的臨(lin) 床用途，還需更多的研究。