大腸杆菌抽取RNA

    之前已分別構築出GUS 基因的表現質體(ti) pQG，要啟動子T5promotor 的啟動受到好的調控，應進一步將pQG 轉形至大腸杆菌M5[pREP4]。 M5[pREP4] 可持續表現lac repressor，pQG 上用以驅動GUS基因表現的T5 promoter 的活性將因而受到抑製，細胞但一旦加入IPTG 就能誘導GUS基因大表現。 在這一節的實驗裏，我們(men) 將分別自經IPTG 誘導與(yu) 未經誘導的pQG/M5[pREP4] 菌體(ti) 抽取total RNA，以以方雜合反應分析GUS mRNA的表現情形。

    下麵所采用的方法適用於(yu) 大腸杆菌及其他革氏陰性菌total RNA的抽取，實驗進時先以lysozyme 分解細胞壁，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）解原生質膜 （Summers, 970; Ausubel et al., 2005）；的後加入適的氯化鈉溶液將SDS、蛋白質及大腸杆菌的染色體(ti) DNA 一並沉澱下，並以離心法移除，存於(yu) 上清液的RNA 則以酒沉澱。 實驗過程所使用的RNase 抑製劑為(wei) DEPC。

    儀(yi) 器用具：恒溫震蕩培養(yang) 箱37℃；冰浴；微離心機；分光光計 （Hitachi U-00 spectrophotometer）

    藥品試劑：大腸杆菌菌株pQG/M5[pREP4];LB 培養(yang) 液;Ampicillin （00 mg/mL）;Kanamycin （25 mg/mL）;IPTG （ M）;Protoplasting buffer （5 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）;Lysozyme （50 mg/mL）;Gram-negative lysing buffer 細胞（0 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0 mM NaCl; mM sodium citrate; .5% SDS）;Diethylpyrocarbonate （DEPC）;飽和氯化鈉溶液 （以40 g氯化鈉溶解於(yu) 00 mL dH2O/DEPC）;酒及70%酒