兔血漿α顆粒膜蛋白（GMP-40）免疫分析

兔血漿α顆粒膜蛋白（GMP-40）免疫分析

實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體(ti) 夾心法測定標本中兔血漿α顆粒膜蛋白GMP-40水平。用純化的兔血漿α顆粒膜蛋白（GMP-40）抗體(ti) 包被微孔板，製成固相抗體(ti) ，往包被單抗的微孔中依次加入血漿α顆粒膜蛋白（GMP-40），再與(yu) HRP標記的血漿α顆粒膜蛋白（GMP-40）抗體(ti) 結合，形成抗體(ti) -抗原-酶標抗體(ti) 複合物，經過*洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血漿α顆粒膜蛋白（GMP-40）呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中兔血漿α顆粒膜蛋白（GMP-40）濃度。

注意事項：

． 試劑盒從(cong) 冷藏環境中取出應在室溫平衡5-30分鍾後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會(hui) 有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3． 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控製在5分鍾內(nei) ，如標本數量多，使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做複孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於(yu) 標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請zui後乘以總稀釋倍數（×n×5）。

5． 封板膜隻限一次性使用，以避免交叉汙染。

6． 底物請避光保存。

7． 嚴(yan) 格按照說明書(shu) 的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀(yi) 讀數為(wei) 準.

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳(chuan) 染物處理。

9． 兔血漿α顆粒膜蛋白GMP-40試劑不同批號組分不得混用。

0. 如與(yu) 英文說明書(shu) 有異，以英文說明書(shu) 為(wei) 準。

樣本處理及要求：

. 血清：室溫血液自然凝固0-20分鍾，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為(wei) 抗凝劑，混合0-20分鍾後，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yang) 上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nei) 的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到00萬(wan) /ml左右。通過反複凍融，以使細胞破壞並放出細胞內(nei) 成份。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鍾左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測，其餘(yu) 冷凍備用。

6. 標本采集後盡早進行提取，提取按相關(guan) 文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑製辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

.標準品的稀釋與(yu) 加樣：在酶標包被板上設標準品孔0孔，在*、第二孔中分別加標準品00μl，然後在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然後從(cong) *孔、第二孔中各取00μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻後從(cong) 第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻後從(cong) 第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻後從(cong) 第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋後各孔加樣量都為(wei) 50μl，濃度分別為(wei) 800ng/L，200ng/L ，600ng/L，300ng/L， 50ng/L）。

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘(yu) 各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品0μl（樣品zui終稀釋度為(wei) 5倍）。加樣將樣品加於(yu) 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。

4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋後備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體(ti) ，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色5分鍾.

0.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後5分鍾以內(nei) 進行。

計算：
兔血漿α顆粒膜蛋白GMP-40以標準物的濃度為(wei) 橫坐標，OD值為(wei) 縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與(yu) OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。