幹擾素檢測方法

幹擾素檢測方法

    幹擾素（IFN）是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，僅(jin) 在同種細胞上發揮作用。根據其來源、理化及生物學性質的不同，可分為(wei) IFN-α、IFN-β、IFN-γ3種幹擾素。其中，IFN-α主要由白細胞產(chan) 生，IFN-β由成纖維細胞產(chan) 生，IFN-γ主要由T細胞在免疫應答中受到抗原或絲(si) 裂原活化後分泌產(chan) 生。3種幹擾素中，IFN-α、IFN-β抗病毒作用較強，IFN-丁免疫調節作用較強。目前已可用基因重組技術製備幹擾素投入臨(lin) 床使用。幹擾素不能直接滅活病毒，其抗病毒作用是由於(yu) 它能激活細胞內(nei) 抗病毒蛋白基因，製造抗病毒蛋白，抑製病毒在體(ti) 內(nei) 複製。幹擾素不僅(jin) 可抑製已感染細胞內(nei) 病毒的複製，而且還可使未感染細胞處於(yu) 抗病毒狀態，對中斷病毒的細胞間傳(chuan) 播有一定作用；但對病毒整合基因可能僅(jin) 有暫時抑製其mRNA的轉錄作用，不能清除病毒基因。幹擾素的免疫調節作用表現為(wei) 它是重要的巨噬細胞活化因子（macro-phageactivating factor，MAF），活化的巨噬細胞能殺死病原微生物或殺傷(shang) 腫瘤細胞。幹擾素能增強各種細胞表達MAF分子從(cong) 而有利於(yu) 遞呈抗原或利於(yu) T細胞對靶細胞的識別和殺傷(shang) ；還能促進T、B細胞的分化，活化NK細胞和中性粒細胞，從(cong) 而有助於(yu) 加強免疫應答。由於(yu) 幹擾素不是一種淋巴細胞的生長因子，故常抑製淋巴細胞（特別是B細胞）的增殖。
    IFN抗病毒活性的特點如下：①僅(jin) 僅(jin) 是抑製作用，IFN消失後病毒將重新複製，因此必須足量反複應用；②有相對的種屬特異性，IFN-γ較IFN-α、IFN-β嚴(yan) 格；③IFN不直接滅活病毒，而是通過細胞基因組產(chan) 生另一些蛋白因子來發揮效能，因此不同細胞對IFN的敏感性不同；④不同感染狀態的病毒-細胞係統對IFN的敏感性不同，病毒大量複製、引起細胞炎症應答時，IFN易產(chan) 生效應；對完整細胞中的整合型病毒無作用。
[檢測方法] ELISA法
[方法學原理] 抗人IFN抗體(ti) 包被在微孔反應板上，待測標本和標準品中的IFN會(hui) 與(yu) 抗人IFN抗體(ti) 結合，遊離的成分被洗去，同時加入化的抗人IFN抗體(ti) 和辣根過氧化物酶標記的親(qin) 和素。與(yu) 親(qin) 和素特異結合，抗人IFN抗體(ti) 與(yu) 結合在單克隆抗體(ti) 上的人IFN結合而形成免疫複合物，遊離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應孔中有IFN，HRP會(hui) 使五色的顯色劑呈現藍色，加終止液變黃色。在波長450nm處測吸光度，IFN濃度與(yu) 吸光度成正比，可通過繪製標準曲線求出標本中的IFN濃度。
[標本準備] 靜脈血2ml，不抗凝。
[試劑）
．預包被微孔反應板
2．濃縮酶結合物
3．酶結合物稀釋液
4．標準晶和標本稀釋液
5．濃縮化抗體(ti)
6．TFN標準品
7．濃縮洗滌液
8. 顯色劑A、B
9．終止液
[儀(yi) 器] 酶標儀(yi) 或全自動酶聯免疫檢測儀(yi) 。
[檢測步驟]
．在微孔反應板相應孔中分別加入待測樣本、不同濃度標準品00ul，再加化抗體(ti) 工作液50ul。
2．振蕩混勻，置20～25℃環境中溫育20min。
3．將孔內(nei) 液體(ti) 吸幹，用洗滌液充分洗滌5次，幹燥。
4．除空白孔外，加入酶結合物工作液00u。 
5．振蕩混勻，置20～25℃環境中溫育30min。
6．將孔內(nei) 液體(ti) 吸幹，用洗滌液充分洗滌5次，幹燥。
7．每孔加入顯色劑A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃環境中避光顯色0min。
8．加入終止液50gl後，輕輕振蕩混勻。用酶標儀(yi) （450nm波長）測定各孔吸光度，與(yu) 標準曲線對照，求出IFN值。
[正常參考值] 各實驗室可根據檢測方法的不同確立正常參考值。
[注意事項]
．試劑盒從(cong) 冷藏環境中取出時應在室溫環境中平衡30min後方可使用，來用完的微孔條用自封袋密封保存。
2．酶標板洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止孔內(nei) 有遊離酶不能洗淨。應設定30-60s的洗滌浸泡時間。
3.滴加試劑前應將滴瓶翻轉數次，使液體(ti) 混勻。滴加時瓶身應保持垂直，以使滴量準確。
4.所有樣品和廢棄物都應按傳(chuan) 染源處理。終止液為(wei) 2mol／L硫酸，使用時應注意安全
5.每批樣本應同時做標準曲線。
6.檢測劑工作液按說明書(shu) 臨(lin) 用前配置。
7.若標本OD值在標準曲線測定範圍以外，應適當稀釋後重測。
[臨(lin) 床意義(yi) ] IFN水平的改變主要見於(yu) 自身免疫性疾病；在感染性疾病中，升高見於(yu) 急性病毒感染，降低見於(yu) 乙型肝炎病毒攜帶者、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者。