大鼠E-選擇素（E-selectin）試劑盒操作說明

大鼠E-選擇素（E-selectin）試劑盒操作說明

試驗原理：
大鼠E-選擇素E-selectin試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知E-selectin 濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nei) 進行檢測。先將E-selectin 和標記的抗體(ti) 同時溫育。洗滌後，加入親(qin) 和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然後加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產(chan) 生顏色。顏色的深淺和樣品中E-selectin 的濃度呈比例關(guan) 係。

操作注意事項

．試劑應按標簽說明書(shu) 儲(chu) 存，使用前恢複到室溫。稀稀過後的標準品應丟(diu) 棄，不可保存。

2．實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

3．不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

4．使用一次性的吸頭以免交叉汙染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5．使用幹淨的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒裏的各種成份及樣品。

6．洗滌酶標板時應充分拍幹，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

7．底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露於(yu) 光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成後應立即讀取OD值。

8．加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

9．按照說明書(shu) 中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法

、血清－－－－-操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管。收集血液後，000×g離心0分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、血漿－－－－-EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用於(yu) 檢測。000×g離心30分鍾去除顆粒。

3、細胞上清液－－-000×g離心0分鍾去除顆粒和聚合物。

4、保存－－－－－－大鼠E-選擇素E-selectin如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反複冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備

．標準品：標準品的係列稀釋應在實驗時準備，不能儲(chu) 存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

400 ng/ml（6號標準品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

200 ng/ml（5號標準品）00ul的原倍標準品加入00ul的標準品稀釋液

00 ng/ml（4號標準品）00ul的5號標準品加入00ul的標準品稀釋液

50 ng/ml（3號標準品）00ul的4號標準品加入00ul的標準品稀釋液

25 ng/ml（2號標準品）00ul的3號標準品加入00ul的標準品稀釋液

2.5 ng/ml（號標準品）00ul的2號標準品加入00ul的標準品稀釋液

0 ng/ml（空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩衝(chong) 液（20×）的稀釋：蒸餾水20倍稀釋。

操作步驟

．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體(ti) 產(chan) 生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chan) 生加樣上的誤差。

2．根據待測樣品數量加上標準品的數量決(jue) 定所需的板條數。每個(ge) 標準品和空白孔建議做複孔。每個(ge) 樣品根據自己的數量來定，能使用複孔的盡量做複孔。

3．加入稀釋好後的標準品50ul於(yu) 反應孔、加入待測樣品50ul於(yu) 反應孔內(nei) 。立即加入50ul的標記的抗體(ti) 。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育小時。

4．甩去孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍幹。重複此操作四次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

5．每孔加入80ul的親(qin) 和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鍾。

6．甩去孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍幹。重複此操作四次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鍾。避免光照。

8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液後應立即測定結果。

9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果分析

大鼠E-選擇素E-selectin以吸光度OD值為(wei) 縱坐標（Y），相應的E-selectin 標準品濃度為(wei) 橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的E-selectin 含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

局限

6號標準品以上的結果為(wei) 非線性的，根據此標準曲線無法得到的結果。

試劑盒性能

．靈敏度：zui小的檢測濃度小於(yu) 號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R值為(wei) 0.990。

2．特異性：不與(yu) 人其它細胞因子反應。

3．重複性：板內(nei) 、板間變異係數均小於(yu) 0%。