快速提取全血RNA的操作步驟

快速提取全血RNA的操作步驟

操作步驟：
*次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量無水乙醇!
使用前將0X紅細胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到X.
操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度%,如 ml RLT 中加入0μl β-巰基乙醇.此裂解液現用現配.配好的RLT 4℃可放置一個(ge) 月.

. 在適合大小的RNase free離心管中加入體(ti) 積（<.5 ml）加入各種抗凝劑新鮮血液 （顛倒混勻後）和3體(ti) 積的紅細胞裂解液RLB,顛倒混勻,可輕彈管壁,確保混勻.

2. 室溫放置0分鍾（期間應該顛倒輕彈混勻數次幫助裂解紅細胞）.
如果RNA降解嚴(yan) 重,可在冰上裂解,但是時間可長一些以充分裂解.

3. 2,000 rpm離心20秒,倒棄紅色上清,並小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細胞團）,留下完整的管底白細胞團. 

離心後在管底應該見到白色的白細胞團,也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團在一起,但是如果看到的是大部分的紅色細胞團,說明紅細胞裂解很不充分,應該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團後重複步驟2,3.

上清盡可能的吸棄,殘留過多會(hui) 稀釋裂解液,造成裂解結合異常,產(chan) 量純度降低.

4. 渦旋或者輕彈管壁將白細胞沉澱*鬆散重懸,加入350μl（<0.5 ml全血）或者600μl（0.5-.5ml全血）裂解液RLT,吹打混勻後用手劇烈振蕩20秒,充分裂解.病人血樣中白細胞數量可能大幅增加,應該適當減少處理量.或者按照350μl（<2x06白細胞）或者600μl（2x06-x07白細胞）比例加RTL.

5. 用帶鈍針頭的一次性 ml（配0.9mm針頭） 注射器抽打裂解物 5-0 次或直到得到滿意勻漿結果（或者電動勻漿30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chan) 量.

6. 較估計裂解物體(ti) 積,加入等體(ti) 積的70%乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,此時可能出現沉澱,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心.

7. 立刻將混合物（每次小於(yu) 700μl,多可以分兩(liang) 次加入）加入一個(ge) 吸附柱RA中,（吸附柱放入收集管中）3,000 rpm離心60秒,棄掉廢液.

8. 加700μl 去蛋白液RW,室溫放置30秒,2,000rpm 離心30秒,棄掉廢液.
如果DNA殘留明顯,可在加入RW後室溫放置5分鍾再離心.

9. 加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,2,000 rpm 離心30秒,棄掉廢液.加入500μl漂洗液RW,重複一遍.

0. 將吸附柱RA放回空收集管中,3,000 rpm離心2分鍾,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑製下遊反應.

. 取出吸附柱RA,放入一個(ge) RNase free離心管中,根據預期RNA產(chan) 量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-80℃水浴中加熱效果更好）, 室溫放置分鍾,2,000 rpm 離心分鍾.

2. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x06白細胞,加30-50μl RNase free water重複步驟,合並兩(liang) 次洗脫液,或者使用*次的洗脫液加回到吸附柱重複步驟一遍（如果需要RNA濃度高）.

洗脫兩(liang) 遍的RNA洗脫液濃度高,分兩(liang) 次洗脫合並洗脫液的RNA產(chan) 量比前者高5–30%,但是濃度要低,用戶根據需要選擇.