穀研試劑-雞蛋中蛋白活性物的分離方法研究

穀研試劑-雞蛋中蛋白活性物的分離方法研究

雞蛋由蛋殼、蛋清和蛋黃三部分組成，是一種營養(yang) 豐(feng) 富，易被人體(ti) 消化吸收的食物。對雞蛋的研究與(yu) 應用，以前多局限於(yu) 對鮮蛋貯存保鮮及其營養(yang) 成分和某些物理性質(如乳化性和起泡性等)進行開發利用，生產(chan) 的產(chan) 品比較單一，產(chan) 品主要有冰蛋、蛋粉、鬆花蛋、蛋黃醬、蛋白片等。近年來，隨著蛋品研究的深入和分離技術的提高，人們(men) 發現雞蛋中含有丈量具有生物活性的成分，如免疫球蛋白。蛋黃可以看作是一種蛋白溶液中含有多種懸浮頸拉的複雜腔體(ti) 體(ti) 係，這些懸浮顆粒中主要含有脂肪、脂蛋自，卵黃磷脂蛋白等。蛋白溶液中剛含有卵黃球蛋白和低密度脂蛋白等。卵黃球蛋白經電泳可得α-、β-、γ-三種組分。卵黃球蛋自，其在免疫學方麵與(yu) 雞血清IgG一致。由於(yu) 其在蛋黃中特異性存在，其蛋白質的物理化學性質、免疫學性質等方麵與(yu) 哺乳動物IgG存在一定差異，所以在比較免疫學領域把由雞蛋黃中獲得的抗體(ti) 稱作IgY(ImmunoglobuIin Yolk)。IgY在分類上仍屬於(yu) 96型免疫球蛋白，分子量比哺乳動物IgG的大，約為(wei) 50000d,係由兩(liang) 條重鏈(Heavy Chain)和兩(liang) 條輕鏈(Light Chain)通過一S一鍵聯接在一起呈γ型結構的大分子蛋白。

自893年Klemperer發現親(qin) 代雞通過雞蛋向幼雛轉移母源抗體(ti) 以後至960年問，科學家們(men) 對各種抗原(細菌、病毒、蛋自質等)引起親(qin) 代雞產(chan) 生特異性抗體(ti) 然後向雞蛋黃中轉移並蓄積的情況進行了許多研究。IgY特異性存在於(yu) 蛋黃中，在雞蛋孵化時轉移戮幼雛血液中。對幼雛生長初期抵抗疾病起著重要作用。

雞蛋黃IgY晟初的應用領域主要包括免疫學診斷和醫藥兩(liang) 方麵：一方麵應用於(yu) 病毒的診斷、特定分子的洳定、食品摻假及殘留分析、測定複雜分子的結構和功能等；另一方麵作為(wei) 醫藥製劑，被用於(yu) 處理感染性腹瀉、防止齲齒等；此外據ThaJly和Carrol報道lgY還可以用於(yu) 抗血毒。

八十年代後，隨著口服被動免疫(Oral Passive Iramunonization)的開發日益受消費者關(guan) 注，IgY開始被當作功能性食品成分單獨使用或添加到食品中應用。通過口服特異性特異性抗體(ti) IgY，作用於(yu) 病原體(ti) ，以達到口腔及消化道感辯性疾病的預防與(yu) 洽療。尤其對那些不能產(chan) 生主動免疫應答(active immune respOnse)的個(ge) 體(ti) ，如新生兒(er) 、有獲得性免疫缺乏症的兒(er) 童，以及由於(yu) 化學治療、營養(yang) 失調或老年化引起免疫功能下降的兒(er) 童或老人等，在其食品中添加免疫抗體(ti) 顯得尤為(wei) 重要。雞蛋中脂質與(yu) 蛋白質之比約為(wei) 2：，其中大部分脂類和蛋白質相結合以脂蛋白的形式存在。這些脂蛋自多數存在於(yu) 蛋黃顆粒中，一部分與(yu) 卵黃球蛋白(包括IgY)同時存在於(yu) 蛋黃漿狀液中，因此，IgY的提純zui重要的一步是去除脂和脂蛋白。

早先IgY主用於(yu) 免疫學研究和臨(lin) 床試驗等方麵，初步脫脂分離常用一些有機試劑，如氯仿。丙酮、丙烷-2-醇等，試劑用量大，成本昂貴。八十年代後隨口服被動免疫的日益受消費者重視，需要大規模生產(chan) IgY，於(yu) 是一些新的分離方法被開發出來。如：

IgY的分離方法

.水稀釋法：簡單的水稀釋法可用於(yu) 蛋黃液中親(qin) 水性部分和疏水性部分的分離。即將蛋黃液稀釋一定倍數，調節溶液pH值，混勻靜置後離心分離或長時間靜置分離。該法生產(chan) 成本低，適於(yu) 規模化生產(chan) ，但由於(yu) IgY被稀釋．給後期提純增加了一定困難。

.2 脂蛋白凝聚劑法：脂蛋白凝聚劑包括聚乙烯乙二醇、葡聚糖硫酸鈉鹽、酪蛋白鈉鹽、聚丙烯樹脂和一些食品增稠劑，如卡拉膠．黃原膠等。這類物質能有效沉集蛋黃中脂與(yu) 脂蛋白．但通常需要超速離心分離。Hajime Hatta等在比較一些天然股對蛋黃臘蛋白的沉集作用時，發現入-卡拉膠可沉集99．5％的臘和脂蛋白，而且普通低速離心(600g)就可達到很好的分離效果。

.3 乙醇-CO2超臨(lin) 界脫脂法：即先用乙醇將蛋黃粉中大部分磷臘質除去，然後用超臨(lin) 界CO2將中性脂肪和殘留的乙醇等同時提出除去。該法IgY活性沒有損失，製得的含抗體(ti) 的蛋白混合物是幹燥狀態的，易保存。而且可將蛋黃中與(yu) 色香味有關(guan) 的卵黃脂類*除去．適於(yu) IgY濃縮蛋白分末(IgY純度約l0％)的大量製造。

.4重複凍融脫脂法：利用蛋黃脂質在低離子強度和中性pU條件下的凝集作用將蛋黃水溶液反複進行冷凍和解凍，以加速脂質的凝聚作用，之後進行離心分離。此法回收率不高(50％以上)，但較經濟。

.5 有機溶劑脫脂法：即用事先預冷至-20℃的有機溶劑．如乙醇等與(yu) 蛋黃液混勻，反複多次漫提其中脂類物質。該法所製IgY的純度高，回收率高．但有機溶劑用量大、成本贏。不適於(yu) 規模化生產(chan) ，另外如果預冷不夠，有機溶劑會(hui) 使IgY部分變性。

雞蛋黃經初步脫脂分離後，可得到一個(ge) 基本上是水溶性蛋白的混合溶液和一個(ge) 主要由脂和脂蛋白組成的沉澱物。要得到純度較高的IgY，則裔進—步純化除去蛋白溶液中的雜蛋白。常見的蛋白質純化方法有鹽析、乙醇沉澱、凝腔過濾、陰離子交換柱分離和超濾等。通常將其中幾種方法結合使用，也有用同一種方法而使用不同分離條件進行分離。

2的分離提純

除在食品工業(ye) 中使用具有一定的潛力外，在臨(lin) 床上同樣也具有巨大的使用潛力。可被用以處理感染、傷(shang) 口、潰瘍以及作為(wei) 一些抗生素的增效劑，還有血液凝固和止血作用，以及組織再生和瘢痕形成促進作用。另據報道，還可以通過和一些病毒形成不溶性聚合物而使病毒失活。

是一種N-乙酰脆壁粘肽水解酶，它可以永解細菌細胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-葡萄糖胺之間的β-(，4)糖苷鍵，而肽聚糖是細菌細胞壁的結構成分。但如果細胞壁肽聚糖的外部被一些囊狀多聚體(ti) 包被或被其他化學基團替代，對細菌細胞壁的作用就會(hui) 降低或被抑製。還可以作用於(yu) 其他一些聚合。在食品中使用給於(yu) 二十世紀60年代，是在建立起有效的工業(ye) 化分離提純方法後才得以實現的，目前已知的可工業(ye) 鈀分離的方法有以下幾種：

2.等電點鹽析法

等電點鹽析法是提取的經典方法，在蛋清溶液中加入5％的NaCl並調節溶液pH值至9.5，靜置結晶。該法回收率可達60-80％，但由於(yu) 大量NaCl的加入影響了剩餘(yu) 蛋清蛋白的應用。

2.2離子交換樹脂分離法

Li—Chan等用弱酸性大孔離子交換樹脂C-464從(cong) 蛋清溶液中吸附，然後用NaCl洗脫。回收率可達90％-95％。該法zui大的優(you) 點是不會(hui) 汙染蛋清中的剩餘(yu) 蛋白。而且可以進行批量和連續生產(chan) ,經過改進，此法可同時提取和抗蛋白。目前。國內(nei) 也開始利廂一些國產(chan) 大孔徑弱酸性離子交換樹儲(chu) 取蛋殼殘留蛋白中提取。

2.3親(qin) 和色譜法

將幾丁質、殼聚糖等可作用的底物固定在一定載體(ti) 上或直接作為(wei) 柱材，利用和底物之間的專(zhuan) 一縫結合，將從(cong) 蛋清中分離。該法生產(chan) 的純度高可達70，400U／mg蛋白，回收率為(wei) 82％。但是該法所用的親(qin) 和支持物的成豐(feng) 高。

2.4反膠束法

利用分子量小和PI值高於(yu) 蛋清中其它蛋白的特點，調節蛋清瘩液的pH值至微堿性，使帶正電荷而其它蛋白帶負電荷，這樣就可以選擇性地進入陰離子表麵活性劑形成的反膠束中，與(yu) 其它蛋白分離。該法萃取率高但需加入有機溶和表麵活性劑，易造成剩餘(yu) 蛋白的汙染。

2.5其它方法

除上述分離方法外，膜分離技術也被用於(yu) 的分離提純，但隻能生產(chan) 活性比較低的粗提產(chan) 品。