穀研試劑-常用蛋白質與非蛋白含氮化合物檢測項目（一）

穀研試劑-常用蛋白質與(yu) 非蛋白含氮化合物檢測項目（一）

一、體(ti) 液總蛋白

體(ti) 液總蛋白包括數量眾(zhong) 多的各種蛋白質，在進行定量測定時作了如下假定：①所有蛋白質都是單純的多肽鏈，糖脂類和金屬有機物等均不計在內(nei) ，其含氮量平均為(wei) 6％；②各種蛋白質理化性質雖不同，但與(yu) 化學試劑的反應性一致。顯然，這過於(yu) 理想化，因此任何一種化學方法測定體(ti) 液總蛋白，均存在一定的缺陷。測定蛋白質一般利用蛋白質特有的結構或

性質：①重複的肽鏈結構；②分子中均含有氮原子；③與(yu) 色素結合的能力；④沉澱後借濁度或光折射測定；⑤和殘基對酚試劑反應或被紫外光吸收。臨(lin) 床實驗室利用以上原理測定體(ti) 液蛋白質的方法有多種，各種方法性能和應用情況不同，zui常用的是雙縮脲法，以下將重點介紹。

(一)雙縮脲法

【檢測原理】蛋白質中的兩(liang) 個(ge) 相鄰肽鍵(一CO—NH一)在堿性溶液中能與(yu) 二價(jia) 銅離子(Cu。’)作用產(chan) 生穩定的紫紅色絡合物。此反應與(yu) 雙縮脲(H：N—Oc—NH—CO—NH：，為(wei) 兩(liang) 個(ge) 尿素分子縮合而成)在堿性溶液中與(yu) Cu。’作用形成紫紅色的反應相似，因此，將蛋白質與(yu) 堿性銅反應的方法稱為(wei) 雙縮脲法(biuret，．method)。

【參考區間】血漿總蛋白隨年齡增大有所增高，60歲後則稍有下降。新生兒(er) 為(wei) 46～70g／L，數月齡到2歲為(wei) 5～75g／L，3歲及以上為(wei) 60~80g／L，成人為(wei) 64～83g／L(直立行走)和60~78g／L(臥床)。

【臨(lin) 床意義(yi) 】血漿總蛋白濃度下降常由白蛋白濃度下降引起；濃度增高主要見於(yu) 慢性炎症等多克隆免疫球蛋白增多，以及漿細胞病的單克隆免疫球蛋白增多症。

【評價(jia) 】

·特異性 因至少含兩(liang) 個(ge) …CO NH 基團才能與(yu) Cu。’絡合，故氨基酸及二肽無反應，三肽以上才能反應。體(ti) 液小分子肽含量極低，對蛋白質來說可忽略不計。

2·呈色一致性 因呈色強度與(yu) 肽鍵數量即蛋白質含量成正比，因此各種蛋白質呈色強度基本相同，在目前所有總蛋白測定方法中。

3·臨(lin) 床應用 本法檢測範圍為(wei) 0～20g／L，靈敏度不高，但很適合血清總蛋白濃度測定，絕大多數正常和病理血清總蛋白均在其檢測範圍內(nei) 。雙縮脲法測定胸腹水總蛋白的檢測低限為(wei) 0．47g／L，生物檢測限為(wei) ．33g／L，胸腹腔積液總蛋白多數在4．5～50g／L，因此能采用該法測定。對蛋白質濃度很低的腦脊液和尿液，該法不是合適的定量方法。

(二)測定體(ti) 液總蛋白的其他方法

·染料結合法在酸性環境下，蛋白質帶正電荷，可與(yu) 染料陰離子反應而產(chan) 生顏色改變，常用染料有氨基黑、麗(li) 春紅、考馬斯亮藍、鄰苯三酚紅鉬等。前兩(liang) 種常作為(wei) 血白蛋白電泳的染料。考馬斯亮藍常用於(yu) 需更高呈色靈敏度的蛋白電泳中，也可用於(yu) 尿液、腦脊液等樣品的蛋白質定量測定，優(you) 點是簡便、快速、靈敏，但比色杯對染料有吸附作用，在自動生化分析儀(yi) 中無法很好地清洗(手工清洗常采用乙醇)。染料結合法均存在不同蛋白質與(yu) 染料結合力不一致的問題。

目前臨(lin) 床上zui常用的是鄰苯三酚紅鉬(pyrogallol red molybdate，PRM)法。其原理是：在酸性介質中，鄰苯三酚紅一鉬酸鹽與(yu) 樣品中的蛋白質形成複合物，使其zui大吸收峰從(cong) 467nm轉移至594nm，在600nto處的吸光度與(yu) 蛋白質濃度成正比。本法靈敏度高，檢測F限為(wei) lO~20mg／L，多數試劑盒的檢測上限約為(wei) 2g／L。試劑不吸附比色杯，可用於(yu) 自動生化分析儀(yi) 中。不足之處仍然是試劑與(yu) 各種蛋白質的呈色

2·凱氏定氮法(Kjeldahl method)該法於(yu) 883年建立，是經典的蛋白質測定方法。其原理是：測定樣品中的含氮量，推算出樣品中的蛋白質含量。蛋白質中含氮量較為(wei) 恒定，平均6％，即lg氮相當於(yu) 6．25g蛋白質。含氮化合物用硫酸加熱分解，在有催化劑存在的條件下，生成硫酸銨，後者再與(yu) 濃堿作用生成NH。OH，采用蒸餾法將氨蒸餾並被硼酸吸收，將硼酸銨用標準鹽酸滴定。根據標準鹽酸的消耗量可算出總氮量，再折算成蛋白質含量。該法定量準確性好，精密度高，靈敏度高，並適用於(yu) 任何形態的樣品測定，至今仍被認為(wei) 是測定許多生物樣品中蛋白質含量的參考方法。但該法操作複雜、費時，不適合臨(lin) 床常規測定。樣品中各種蛋白質含氮量有少許差異，尤其在疾病狀態下差異可能更大。對於(yu) 非蛋白含氮化合物較高的血清樣品，則還要測定無蛋白血濾液中非蛋白氮含量並將其扣除。

3·比濁法(turbidimetry) 某些酸如三氯乙酸、磺基水楊酸等能與(yu) 蛋白質結合而產(chan) 生微細沉澱，由此產(chan) 生的懸浮液濁度大小與(yu) 蛋白質的濃度成正比。該法的優(you) 點是操作簡便、靈敏度高，可用於(yu) 測定尿液、腦脊液等蛋白質濃度較低的樣品；缺點是影響濁度大小的因素較多，包括加入試劑的手法、混勻技術、反應溫度等，且各種蛋白質形成的濁度亦有較大的差別。目前臨(lin) 床上較多應用的是苄乙氯銨法，其原理是：苄乙氯銨在堿性條件下與(yu) 蛋白質形成沉澱，其懸浮液穩定，可在660nm處進行濁度測定。該法是比濁法中較好的方法，其靈敏度、準確度以及對白蛋白和球蛋白的反應一致性都優(you) 於(yu) 其他比濁法，檢測範圍較廣，可用於(yu) 自動化分析，然而其精密度仍不夠理想。

4．酚試劑法(phenol reagent method) 由Folin於(yu) 92年*，早期用於(yu) 和測定，後由吳憲開始用於(yu) 蛋白質定量。酚試劑法的原理是運用蛋白質中和使磷鎢酸和磷鉬酸還原為(wei) 鎢藍和鉬藍。該法靈敏度較高。Lowry將酚試劑法進行了改良，先用堿性銅溶液與(yu) 蛋白質反應，再將銅．肽鍵絡合物中的和與(yu) 酚試劑反應，產(chan) 生zui大吸收在745～750nm的顏色，使呈色靈敏度更為(wei) 提高，達到雙縮脲法的00倍左右，有利於(yu) 檢出較微量的蛋白質。各種蛋白質中和的含量不同，如白蛋白含0．2％，而球蛋白含2％～3％，因此本法不適合測定混合蛋白質，隻適合測定單一蛋白質，如測定組織中某一蛋白質抽提物。該法易受還原性化合物的幹擾，如帶一SH的化合物、糖類、酚類等。

5．直接紫外吸收法根據蛋白質分子在280nm或25／225nm的紫外吸光度值計算蛋白質含量。其原理是：芳香族氨基酸在280nm處有一吸收峰，可用於(yu) 蛋白質的測定。因生物樣品常混有核酸，核酸zui大吸收峰為(wei) 260nm，在280nm也有較強的光吸收，因而測得的蛋白質濃度可采用兩(liang) 個(ge) 波長的吸光度予以校正，即蛋白質濃度(g／I。)：．4：80nto。一0．74A：60nm。該法準確性受蛋白質分子中芳香族氨基酸的含量影響甚大，而且尿酸和在280nm附近有幹擾，所以不適合血清、尿液等組成複雜的體(ti) 液蛋白質測定，常用於(yu) 較純的酶、免疫球蛋白等測定。本法不加任何試劑且不需要處理，可保留製劑的生物活性，可回收全部蛋白質。