穀研試劑-細胞受體結合免疫測定CIC法

                           穀研試劑-細胞受體(ti) 結合免疫測定CIC法

  細胞受體(ti) 結合免疫測定法是根據CIC可與(yu) 某些細胞表麵的Fc受體(ti) 或補體(ti) 受體(ti) 結合而建立的細胞技術，這類方法有靈敏度較高，特異性較強等優(you) 點，但需進行活細胞培養(yang) 或細胞分離，影響因素多，重複性較差，目前僅(jin) 適用於(yu) 實驗研究。此類技術有多種方法。

    Raji細胞是從(cong) Burkitt淋巴瘤患者分離建株的B淋巴細胞係。可在體(ti) 外連續傳(chuan) 代培養(yang) ，細胞表麵沒有膜免疫球蛋白，Pc受體(ti) 的親(qin) 和力很低，但有C3、C3b和C3d受體(ti) 及Clq受體(ti) ，而且不易脫落。因此能使結合補體(ti) 的IC吸附在細胞上，然後再於(yu) 反應係統中加入熒光素或i25標記的抗人IgG抗體(ti) ，使其與(yu) 結合在Raji細胞上的IC中的IRC反應，計算Rail細胞上結合的IC中滲入的核素量，即可判定IC的存在與(yu) 含量。

(一)試劑

    ．Raji細胞懸液  將Raji細胞培養(yang) 在含20％小牛血清的RPMI-640培養(yang) 液中2—3d後即可收集應用，該細胞培養(yang) 時不貼壁、不結團，生長容易(一般3d即可傳(chuan) 一代)，培養(yang) 條件不苛求。但pH值應在6．5左右，超過pH7．0則生長不良。收集細胞時要計數和檢查活細胞，台盼藍排除試驗要求活細胞在95％以上。

    2．核素標記抗IgC抗體(ti)   將兔抗人IgC血清經DE52分離兔IsC，用PBS稀釋成蛋白質mg／mL，按每ug蛋白質結合0．3uCi25I標記抗人IgC抗體(ti) 。

(二)操作步驟

    ．取培養(yang) 72h的Raji細胞 800r／rain離心0rain，棄去上清液，細胞沉澱中加入不含小牛血清的640培養(yang) 液，洗2次。

    2．計數Raji細胞數，用*640培養(yang) 液配成07／mL細胞懸液。

    3．取滴細胞懸液加等量0．％台盼藍，放37℃0rain，鏡檢著色細胞不應超過5％。

    4．在試管中加入細胞懸液50~L，再加入：4稀釋的受檢血清25uL。

    5．搖勻後放37~(2 45rain，每5-0rain輕搖一次，使其充分作用。

    6．用640培養(yang) 液將細胞洗滌3次， 000r／min離心5min，棄去上清液。

    7．在細胞沉澱物中加25I標記的抗人TgG抗體(ti) ，用含％人血清白蛋白(HSA)的640培養(yang) 液將標記物稀釋成7-0ug／mL。加入標記物後置4℃30min，每間隔5—0min輕搖次。

    8．用含％人血清白蛋白(HSA)的640培養(yang) 液洗滌3次，每次 800r／rain離心0min。

    9．取細胞沉積物用Y計數器測cpm值。

  0．用熱變性IgG40ug溶於(yu) 50uL新鮮混合人血清中，然後倍比稀釋成0個(ge) 稀釋度，按上述方法操作測定cpm。

(三)結果判斷

    以熱聚合IgC的含量為(wei) 橫坐標，cpm為(wei) 縱坐標繪製標準參考曲線。自參考曲線查出IC中IgC的ug數，按ug/mL報告。

(四)注意事項

    ．Raji細胞有時也帶有Pc受體(ti) 和表麵膜免疫球蛋白，為(wei) 使實驗結果反映真實情況，應預試條件，同時在實驗中加陰性對照。

    2．用熱變性IsC作對照和參考時，一定要用新鮮血清作稀釋劑，以補充補體(ti) 。

除此以外，細胞受體(ti) 結合免疫測定方法中的血小板凝集試驗亦用於(yu) 實驗研究。其原理是免疫複合物與(yu) 血小板相互作用後引起血小板表麵發生改變，導致血小板凝集(有人認為(wei) 血小板凝集與(yu) 其表麵Fc受體(ti) 活化有關(guan) )。試驗中必須采用新鮮分離的有活力的血小板，因為(wei) 在IC存在時，血小板表麵的改變有賴於(yu) 其代謝狀態。除IC外，高濃度的遊離免疫球蛋白與(yu) 血小板表麵抗原反應的抗體(ti) 和其他物質，如荷電分子、蛋白水解酶和某些粘病毒也可使血小板聚集；Clq、IgM、RF能抑製IC引起的血小板聚集；待檢血清於(yu) 試驗前加熱滅活，會(hui) 使其血小板凝集滴度升高或降低。