穀研試劑-活化微珠的交連

                            穀研試劑-活化微珠的交連

           elisa試劑盒抗體(ti) 與(yu) 固相基質共價(jia) 結合的另一種常用方法是利用多種化學試劑使微珠活化，然後將純化的抗體(ti) 與(yu) 活化的微珠結合。這種方法有許多優(you) 點，通常可以在超越蛋白質能夠耐受的苛刻條件下使微珠活化，因此可以采用很多激活方法。此外，許多結合方法形成的交連，在範圍廣泛的變性條件下仍保持穩定。另一個(ge) 優(you) 點是許多活性微珠有商品出售。總的說來，商品化的微珠為(wei) 免疫親(qin) 和純化提供了較好的活化微珠。

    ．準備工作

    應用抗體(ti) 柱對各種進行親(qin) 和純化的主要特點是在足夠溫和的條件下就能將抗原從(cong) 層析柱上洗脫，並能保持蛋白質的結構和／或功能不改變。洗脫的難易是由連接抗原與(yu) 抗體(ti) 之間結合鍵的類型和數量決(jue) 定的。在製備大規模層析柱用於(yu) 純化之前，有必要對所有可利用的抗體(ti) 進行測試，從(cong) 中選擇適當的抗體(ti) 製備親(qin) 和層析柱。

    所製備的抗體(ti) 緩衝(chong) 液中不應含有無關(guan) 的化合物，因其可通過反應基團結合到活性微珠上，這種結合反應很可能就發生在抗體(ti) 的氨基(或巰基)上。如果這些化合物是在抗體(ti) 純化時使用，所製備的抗體(ti) 必須對0．5mol／LPBS(pH7，5)結合緩衝(chong) 液充分透析。

    2．所需溶液、試劑和特殊設備

    純化的抗體(ti) ；    0．5mmol／L磷酸鈉(pH7．5)；    含mol／LNaCi的0．05mol／L磷酸鈉溶液(pH7．5)；    00mmol／L乙醇胺(pH7．5)    搖床。

             elisa試劑盒 3．操作步驟

    ()用0．5mol／L(pH7．5)的磷酸鈉溶液將抗體(ti) 配成所需濃度。留少量樣品供測定結合效率用。每次實驗用於(yu) 結合的抗體(ti) 的量都不相同。在大多數實驗中每毫升微珠內(nei) 加0mg抗體(ti) 可得到較高容量層析柱。

    (2)加入按產(chan) 品使用說明製備的活化的微珠

    (3)置搖床上輕輕混合放室溫過夜。

    (4)用0．5mol／L磷酸鈉(pH7．5)洗滌微珠2次。留取結合過夜的上清，  比較結合前、後樣本中的蛋白含量。

    (5)用含mol／LNaCl的0．05mol／L磷酸鈉溶液(PBS，pH7．5)洗滌微珠次。

    (6)加0倍體(ti) 積的00retool／L乙醇胺(pH7．5)室溫下孵育4h或過夜，振蕩。

    (7)用PBS洗滌2次，加入0．0％硫柳，免疫微珠可置4C貯存，數月內(nei) 保持穩定。

    製備好的微珠即嗬用於(yu) 抗原的免疫親(qin) 和純化

    常見問題

    將抗體(ti) 有效地結合到活性微珠上雖是——項簡單的工作，但保持抗體(ti) 的活性常很困難。抗體(ti) 失活大多是由於(yu) 抗體(ti) 與(yu) 微珠過度偶聯，或偶聯發生在抗體(ti) 的抗原識別區。這兩(liang) 種結果都會(hui) 使抗體(ti) —微珠基質結合抗原的能力顯著低於(yu) 未偶聯的同量抗體(ti) 。保持0％-50％的結合活性較為(wei) 常見，並可認為(wei) 是活性良好水平。在偶聯過程中，如果抗體(ti) 的活性遠遠低於(yu) 這一水平，可采取下列三種措施保持抗體(ti) 活性。

    *種控製失活的重要方法是在廣泛偶聯之前終止反應，偶聯率可以在開始實驗前測定。當不到50％的抗體(ti) 結合時即停止反應，未結合的抗體(ti) 不會(hui) 受到損害，可以在其他實驗中再使用，及早終止反應可以控製每種抗體(ti) 通過許多不同位點偶聯。終止結合反應的恰當時間可通過一個(ge) 小規模的不同作用時間來確定。未偶聯的抗體(ti) 可通過SDS隅聚丙烯酰胺凝膠電泳，和考馬斯亮藍染色來測定重鏈和輕鏈條帶。

    第二種防止過度偶聯的方法是調整反應的pH值以減慢偶聯速度。大多數偶聯方法是通過抗體(ti) 上的氨基連接，而氨基基團的反應對pH值較敏感。如果抗體(ti) 偶聯的pH值低於(yu) 氨基基團的pK值，大多數氨基基團在任何時候都不會(hui) 發生偶聯，這樣就控製了過度偶聯率。下述方法采用中性的pH值，有助於(yu) 這一問題的解決(jue) 。如果仍然出現過度偶聯，可以試用略低的pH值。選用合適的pH值需憑經驗通過多次試驗才能確定，不同的抗體(ti) 所需的條件也不一樣。可以采用逐漸降低pH值單位(如0．5)的方式來測試新的實驗條件。另一方麵，如果出現太低的偶聯率，可以增加緩衝(chong) 液的pH值，延長偶聯時間。pH值在8．2以上時，可用0．5mol／L碳酸鹽緩衝(chong) 液代替磷酸鹽緩衝(chong) 液。

    第三種減少過度偶聯問題的方法是將其他氨基基團引入抗體(ti) 偶聯反應。在預備試驗時，用不同濃度的帶有一級氨基基團的小分子物質阻斷抗體(ti) 結合到微珠上。2種zui常用的化合物是乙醇胺和。從(cong) 中選一個(ge) 適當濃度的封閉劑使偶聯過程中隻有約0％的抗體(ti) 結合。選擇一個(ge) 合理的起始濃度，建議抗體(ti) 的zui終濃度不超過0mg／m濕微珠。

    zui後，所用的抗體(ti) 可能有一個(ge) 氨基基團是分布在抗原結合位點內(nei) 。這個(ge) 位點與(yu) 大多數活性微珠結合後特別容易失活。如果在偶聯反應中，抗原結合能力不斷喪(sang) 失，可改用蛋白A或蛋白G微珠，以及使用不依賴於(yu) 氨基基團的雙功能交聯劑進行偶聯。