穀研試劑-用ELISA法檢測幽門螺杆菌抗體

用ELISA法檢測幽門螺杆菌抗體(ti)
摘要：
983年Warren和Marshall從(cong) 人胃粘膜成功地分離出幽門螺杆菌（Hp）之後，Hp與(yu) 胃炎、消化性潰瘍的相關(guan) 性引起人們(men) 的興(xing) 趣。人們(men) 推測其可能成為(wei) 這類疾病的致病因素之一。許多研究者正進一步探索其致病機理，並從(cong) 不同角度尋找快速、可靠的檢測方法。迄今為(wei) 止，檢測Hp的方法包括組織標本培養(yang) ，切片染色，細菌直接塗片染色，快速尿素酶測定及3C尿素呼吸試驗和4C尿素呼吸試驗等

相關(guan) 專(zhuan) 題ELISA免疫實驗技術
983年Warren和Marshall從(cong) 人胃粘膜成功地分離出幽門螺杆菌(Hp)之後，Hp與(yu) 胃炎、消化性潰瘍的相關(guan) 性引起人們(men) 的興(xing) 趣。人們(men) 推測其可能成為(wei) 這類疾病的致病因素之一。許多研究者正進一步探索其致病機理，並從(cong) 不同角度尋找快速、可靠的檢測方法。迄今為(wei) 止，檢測Hp的方法包括組織標本培養(yang) ，切片染色，細菌直接塗片染色，快速尿素酶測定及3C尿素呼吸試驗和4C尿素呼吸試驗等。除尿素呼吸試驗外其餘(yu) 方法均需通過胃鏡檢查才能完成，鑒於(yu) 取材困難，進一步尋找檢測Hp感染的免疫學方不進非常必要的。國外有人用酶聯免疫吸附試驗(elisa)檢測臨(lin) 床病人血清中有Hp抗體(ti) 報道，國內(nei) 尚未有這方麵研究報告。本文報道建立一種檢測人體(ti) 抗Hp抗體(ti) 的ELISA的實驗結果及與(yu) 細菌培養(yang) 法和尿素酶測定法對比檢測結果，研究證明本法特異、敏感、適用於(yu) 大量標本普查和及時判斷治療反應，現將結果報告如下。
材料和方法
. 材料
①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三廠產(chan) 品。②酶聯板離心籃：根據40孔酶聯板本實驗室自行設計製成。③DG—Ⅰ型酶聯免疫檢測儀(yi) ：南京華東(dong) 電子管廠產(chan) 品。④試劑：過氧化物酶(HRP)，R2=3.2，美國sigma公司產(chan) 品。鄰苯二胺(OPD)：上海白鶴化工廠產(chan) 品，按文獻配製。包被液：取碳酸鈉.59g加2.93g，蒸餾水000ml配成。洗滌液：以上未加吐溫—20的洗滌液00ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液：5%小牛血清。戊二醛固定液：25%戊二醛液，00ml裝，Kochligh進口分裝，用時稀釋成0.25%戊二醛固定液。終止液：2NH2SO4。⑤抗原的製備：將澳大利亞(ya) *佩思醫院的Hp標準菌株(NCTC638)及從(cong) 胃鏡檢查患者胃粘膜活檢標本分離出的Hp菌株分別接種於(yu) 心腦血平板，37℃培養(yang) 5d後取菌落作生化與(yu) 血清學鑒定(自製兔抗Hp抗體(ti) )，然後取單個(ge) 菌落移種於(yu) 另一血平板，繼續培養(yang) 3d，經鑒定後將其大量增殖培養(yang) ，3d後將菌苔刮下，置生理鹽水中製成菌液，加福爾馬林固定(0.%～0.3%)，4℃過夜，3000r/nin離心30min，沉澱3次，將zui後次沉澱懸於(yu) 少量PBS液內(nei) ，用比濁管沒出細菌濃度，製成含菌3×09ml，置冰箱冰凍，反複凍融3次，經顯微鏡檢查無菌體(ti) 存在後，製成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，-20℃保存備用。⑥臨(lin) 床血清標本：采自胃鏡檢查患者，隨機采取988年8～0月胃鏡檢查病人共38人，抽靜脈血2ml，分離血清貯存-20℃備用。⑦陰性對照血清，進行ELISA測定，取其平均OD值作對照。⑧酶標羊抗人IgG結合物(SAHIgG—HRP)的製備：按過碘酸鹽改良法，略加改進標記製成酶標抗體(ti) 。即HRP8.0ml，22℃較攪20min。加乙二醇6滴，繼續攪拌5min，對pH4.2，0.00mol/L醋酸鹽緩衝(chong) 液(用2molHC調pH)透析過夜，中間換水4次，加羊抗人IgG(上海生物製品研究所產(chan) 品)4mg，逐滴加pH，.0mol碳酸鹽緩衝(chong) 液，使pH升到9.0～9.5，室溫較攪2h，加硼氫化鈉(4mg/ml)0.2ml，置4℃2h，對pH7.2，0.0molPB-0.4molNaCl緩衝(chong) 液在4℃透析平衡。換水4次，收取透析袋內(nei) 結合物，以50%飽和度硫酸銨溶液鹽析去除遊離酶後，測定精製結合物，E/P克分子比值合格後，將結合物小瓶分裝置-20℃保存，備用。⑨尿素酶測定法和Hp的分離培養(yang) 法參考文獻進行。
.2 方法
並稍加改進，即：抗原包被微量滴定板：用包被液將抗原按2×08億(yi) /ml(含蛋白8.6μg)稀釋後，每孔加00μ，離心籃離心20min2000r/min後，倒去孔內(nei) 液體(ti) ，然後加入0.25%戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗滌液洗3次(每次3min)，加5%小牛血清液，200ml/孔，經37℃30min封板後倒去孔內(nei) 液體(ti) 。每孔加待檢血清(：00稀釋)00ml，37℃保溫h後，如上洗滌3次，同時做陰性對照孔和空白孔。之後於(yu) 各孔內(nei) 加和新鮮稀釋的酶標羊抗人IgG結合物00ml，37℃保溫半小時，於(yu) 各孔中加入2NH2SO450μl終止反應後，於(yu) 酶聯測定儀(yi) 以波長490nm測定OD值，將測得標本OD值(P)與(yu) 陰性對照OD值(N)比(P/N)，若P/N比大於(yu) 或等於(yu) 2.0為(wei) 陽性。用ELISA法檢測幽門螺杆菌抗體(ti)