植物RNAout

植物RNAout
產(chan) 品及特點 本產(chan) 品是天澤基因自主開發的*產(chan) 品，其原理*不同於(yu) 異硫氰酸胍/酚/氯仿提取方法，克服了後者不能區分RNA （本質上是多糖）和其他植物多糖的缺點，能將RNA和其他植物多糖分開，同時還能有效去除多酚和其他植物次級代謝成份。其有效性在近五十多種各類植物（見附錄，包括十分棘手的鬆柏類植物）中得到驗證。
. 適用於(yu) 絕大多數植物，從(cong) 五十多種植物材料中都成功提取到了總RNA，其中包括鬆針、柏樹、香蕉等用胍/酚/氯仿方法未能提取到RNA的植物（注：部分植物組織，如果實， RNase含量*, 需要另外加RVC抑製其活性）。
2. 操作簡單快速，zui短可以隻需要約十五分鍾，可以全在室溫下進行。
3. 得到的RNA平均 OD260/280在.9左右，可直接用於(yu) RT-PCR和Northern等研究。
規格及成分 成份 50 次包裝 250 次包裝
溶液A 50 mL 250 mL
溶液B 5 mL 75 mL
溶液C 25 mL 25 mL
溶液D 25 mL 25 mL
使用手冊(ce) 份 份

運輸及保存 常溫運輸，4℃保存，有效期一年。
自備試劑 氯仿、75%乙醇、RNA溶解液。
使用方法 . 準備
a） 估算試劑和組織細胞的用量並準備足夠的氯仿、75%乙醇和RNA溶解液 （如RNASAVER、無RNase的水或有滅活殘留RNase活性的液相RNase清除劑）。每次微量提取一般需要00-200 mg植物葉片、或50-00 mg植物種子、或200-500 mg植物果實。
b） 溶解溶液A沉澱。溶液A在4℃放置後可能會(hui) 產(chan) 生沉澱，使用前必須放在65℃水浴使沉澱*溶解。
2、 勻漿
a） 先將新鮮植物切成小塊（保存在RNALOCKER中的植物組織需用紙吸去RNALOCKER液體(ti) 後再剪切成小塊），放入0-5 mL塑料離心管中，加入 mL溶液A，然後用勻漿器勻漿5-20秒，將不超過 mL的勻漿液轉移至幹淨的.5 mL塑料離心管中（可以不必轉移非液體(ti) 的細胞碎片）。勻漿時會(hui) 產(chan) 生泡沫，但不影響提取效果。有的植物組織（果實）含有大量水份，勻漿液會(hui) 多於(yu) mL，轉移時也隻取 mL。
b） 如果用硯磨法破碎植物組織，需將植物組織浸泡在 mL溶液A中再硯磨，盡量避免植物組織跟空氣直接接觸，然後將硯磨物轉移到新的.5 mL離心管中。
3、 *次分相
a） 在裝有裂解物的離心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自備氯仿，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。
b） 室溫2000-5000 g離心5分鍾，兩(liang) 相間將有約5-0毫米厚的細胞破碎物。
c） 將上清液（約0.8 mL）轉移到另一幹淨的.5 mL塑料離心管中，下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質和其他雜質，避免觸及或吸取。留下00 uL上清液不取。
4、 第二次分相
a） 在上清液中加入0.5 mL的溶液C和0.2 mL的自備氯仿，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。
b） 室溫2000-5000 g離心3分鍾，兩(liang) 相間將有白色膜狀物（蛋白質）形成。
c） 將上清液（約 mL）轉移到另一幹淨的.5 mL塑料離心管中,避免觸及或吸取有機相及其上麵的白色膜狀物。
5、 沉澱
a） 在上清液中加入0.5倍體(ti) 積的溶液D，用手上下顛倒或振蕩器振蕩30秒混勻，此時溶液呈白色渾濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。如果提取 50 mg以下的微量植物組織樣品，在此步加入天澤基因的微量助沉劑RNADOWN。
b） 室溫2000-5000 g離心3-5分鍾，RNA將在管底形成白色沉澱（約黃豆大小）。如果組織樣品量少或需要提高RNA回收率，也可以延長離心時間到20-30分鍾。
c） 小心移棄上清液，避免觸及管底RNA沉澱。
注意：如果加入溶液D離心後沉澱漂浮在上麵，說明植物糖份多，溶液比重大，可以少加植物樣品，也可以適當加無RNase的水稀釋直到沉澱能夠沉下去為(wei) 止。如果離心後管底有類似氯仿的相出現，說明上一步離心時間不夠或取上清時取到了下層的有機相，可以適當延長離心時間或取上清時留下約00 uL不取或在第四步時加0.3 mL的自備氯仿。
6、 *次清洗
a） 在離心管中加入mL 75%的乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒。
b） 室溫2000-5000 g離心分鍾，RNA將在管底形成細小沉澱（約芝麻大小）。
c） 小心吸棄上清液,注意不要吸棄RNA沉澱。
7、 第二次清洗
a） 重複第六步一次。
b） 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液,注意不要吸棄沉澱。此步將有效去除殘留的乙醇，否則後續反應會(hui) 受到影響。
8、 溶解
a） 加入適量（一般為(wei) 20-00 μL） RNA溶解液使RNA沉澱溶解，存放於(yu) -80℃或立即使用。千萬(wan) 不要用真空離心法使RNA沉澱過於(yu) 幹燥,否則RNA將變得十分難溶。
9、 檢測
a） RNA完整性的電泳檢測
如果需要做Northern雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行RNA電泳，因為(wei) 非變性膠不能分離所有的RNA分子（BioTechniques，28：44，2000）。如果是簡單檢測，可以使用TAE或天澤基因的SuperBuffer-2 DNA/RNA兩(liang) 用快速電泳液，但文獻報道必須使用變性上樣液（BioTechniques，9：558，990）。普通DNA上樣液不含變性劑，也沒經過去RNase處理，所以不要使用。
尤其需要注意的是不要使用TBE進行RNA電泳，因為(wei) TBE所含硼酸是研究多糖的經典方法－－－－硼酸絡合法中的關(guan) 鍵成分，硼酸通過與(yu) RNA核糖中的羥基發生絡合反應，形成RNA分子內(nei) 或RNA分子間的絡合複合物，使同樣長度的RNA具有不同的泳動速度，電泳條帶彌散，同時有大的RNA絡合複合物遲留在加樣孔中（一般會(hui) 誤以為(wei) 是基因組DNA汙染）。RNA分子內(nei) 或RNA分子間的絡合物的形成的多少和比例又與(yu) 硼酸與(yu) RNA的數量比例有關(guan) ，而RNA樣品中汙染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也會(hui) 參與(yu) 此反應，使硼酸對RNA電泳的影響更複雜，所以TBE對RNA電泳的影響沒有規律性和重複性。有的樣品可以使用有的又不行，是避免使用。
由於(yu) 動物細胞中70-80%的RNA為(wei) rRNA，後者又由28S （約4800 nt），8S （約900 nt）和5.8S （約20 nt）三種組成，所以變性膠電泳後應該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。由於(yu) 核酸長度與(yu) 結合EB的數量成正比（當然還與(yu) RNA的二級結構有關(guan) ，雙鏈部分結合能力比單鏈部分強），所以28S rRNA條帶的熒光強度一般比8S rRNA條帶的熒光強度強.5-2.3倍。如果這兩(liang) 條rRNA帶不清晰或比例小於(yu) 此範圍則表示RNA有降解（因為(wei) 大的RNA被酶降解的可能更大）。
跟動物一樣，植物果實和種子的RNA一般有三條電泳帶，但植物葉片的RNA有四條或更多rRNA帶，多餘(yu) 的RNA來源於(yu) 葉片中大量存在的葉綠體(ti) 。
b） RNA產(chan) 量產(chan) 率測定
將5-0 μL RNA溶於(yu) TE緩衝(chong) 液中（pH7.5-8.2之間）檢測其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度（ OD260的RNA=40 μg/mL），進而計算出RNA的產(chan) 量（濃度X體(ti) 積）和產(chan) 率（RNA產(chan) 量/組織用量）。
注意不要將RNA稀釋在DEPC水中檢測OD260和OD280，否則光吸收比在TE中測得的低0%-5%，因為(wei) 核酸光吸收跟溶液pH相關(guan) ，而DEPC水中的DEPC高壓分解後產(chan) 生的CO2 與(yu) 水反應生成碳酸，使溶液pH降低進而降低RNA的光吸收。RNA的產(chan) 率還隨組織的營養(yang) 狀態和組織的種類不同而不同，00 mg種子的RNA產(chan) 量一般為(wei) 00-20 μg，00 mg葉片為(wei) 30-60 μg, 00 mg果實為(wei) 20-40 μg。
c） RNA純度測定
無汙染的總RNA的OD260/OD280一般在.8-2.之間（具體(ti) 數值與(yu) 其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guan) ），OD260/OD230一般在2.0-2.3之間，如果低於(yu) 或高於(yu) 此範圍則分別表示樣品可能有蛋白質或多糖的汙染，但一般不影響RT-PCR等反應。蛋白質汙染可以通過酚/氯仿抽提一次然後酒精沉澱去除，DNA和多糖汙染可以分別用天澤基因的DNA Erasol 和PS Erasol去除。