ROS的流式檢測

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 活性氧檢測試劑盒（Reactive oxygen species assay kit）是一種利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nei) 後，可以被細胞內(nei) 的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從(cong) 而使探針很容易被裝載到細胞內(nei) 。細胞內(nei) 的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nei) 活性氧的水平。 本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup以便於(yu) 活性氧的檢測。Rosup是一種混合物（compound mixture），濃度為(wei) 50mg/ml。

一、注意事項

、探針裝載後，一定要洗淨殘餘(yu) 的未進入細胞內(nei) 的探針，否則會(hui) 導致背景較高。

2、探針裝載完畢並洗淨殘餘(yu) 探針後，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。

3、盡量縮短探針裝載後到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

4、為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

二、使用說明

、裝載探針

對於(yu) 刺激時間較短（通常為(wei) 2小時以內(nei) ）的細胞，先裝載探針，後用活性氧陽性對照及自己感興(xing) 趣的藥物刺激細胞。對於(yu) 細胞刺激

時間較長（通常為(wei) 6小時以上）的細胞，先用活性氧陽性對照及自己感興(xing) 趣的藥物刺激細胞，後裝載探針。

原位裝載探針：本方法僅(jin) 適用於(yu) 貼壁培養(yang) 細胞。按照：000用無血清培養(yang) 液稀釋DCFH-DA，使終濃度為(wei) 0微摩爾/升。去除細胞培養(yang) 液，加入適當體(ti) 積稀釋好的DCFH-DA。加入的體(ti) 積以能充分蓋住細胞為(wei) 宜，通常對於(yu) 六孔板的一個(ge) 孔加入稀釋好的DCFH-DA的體(ti) 積為(wei) 毫升。37℃細胞培養(yang) 箱內(nei) 孵育20分鍾。用無血清細胞培養(yang) 液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nei) 的DCFH-DA。

通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鍾後可以顯著提高活性氧水平。

收集細胞後裝載探針：按照：000用無血清培養(yang) 液稀釋DCFH-DA，使終濃度為(wei) 0微摩爾/升。細胞收集後懸浮於(yu) 稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為(wei) 一百萬(wan) 至二千萬(wan) /毫升，37℃細胞培養(yang) 箱內(nei) 孵育20分鍾。每隔3-5分鍾顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yang) 液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nei) 的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照及自己感興(xing) 趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若幹份後刺激細胞。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鍾後可以顯著提高活性氧水平。

2.、檢測

對於(yu) 原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞後用熒光分光光度計、熒光酶標儀(yi) 或流式細胞儀(yi) 檢測。

對於(yu) 收集細胞後裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀(yi) 或流式細胞儀(yi) 檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。

3、參數設置

使用488nm激發波長，525nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前後熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數設置檢測DCF。DCF的激發光譜和發射光譜參考下圖。

4、其它說明

陽性對照可以按照：000的比例使用。例如裝載好探針的細胞共毫升，可以加入微升的陽性對照刺激。通常刺激後20-30分鍾內(nei) 可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對於(yu) 不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激後30分鍾內(nei) 觀察不到活性氧的升高，可以適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當降低活性氧陽性對照的濃度。

另外，對於(yu) 某些細胞，如果發現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照：2000-：5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為(wei) 2-5微摩爾/升。探針裝載的時間也可以根據情況在5-60分鍾內(nei) 適當進行調整。