同種反應性Th和CTL克隆的製備

 

同種反應性是指未免疫的鼠或人T細胞對同種異體細胞上組織相容性抗原的反應。盡管同種反應性T細胞克隆可從未免疫的脾細胞或淋巴細胞製備，但經同種抗原預刺激的細胞所獲反應細胞的頻率較高。細胞毒性和非細胞毒性T細胞可經有限稀釋進行克隆。

 

材料與試劑

 

. 同種反應性鼠脾T細胞；

 

2. 以2000rad照射的同種鼠脾細胞作為刺激細胞。

 

3. 細胞培養所需的試劑和設備

 

4. 條件培養液（條件液）的製備

 

除了重組淋巴因子可用於T細胞克隆外，各種類型的條件培養液均可作為T細胞克隆的生長因子（T cell growth factors， TCGF）。不同的條件培養液含有不同的淋巴因子。ConA誘導的細胞培養上清含有大量的IL-2，但IL-4和IFN-γ的含量較低，而繼發MLC培養上清含高水平IFN-γ，IL-2。PMA（TPA）激活的EL-4腫瘤細胞上清（EL-4上清）含IL-2。由此可根據不同的克隆選用不同的條件培養液。

 

① ConA誘導的細胞培養上清（ConA上清）：於24孔培養板孔中加入.25×06/ml鼠脾細胞和2.5μg ConA，置37℃5%CO2 溫箱培養24～48h，離心收集上清，以CTLL-2或HT-2細胞檢測其IL-2含量，分裝，置-70℃保存備用。

 

② 繼發MLC培養上清：取C57BL/6鼠脾細胞2.5×07 （反應細胞）與等量經過照射（2000rad）的DBA/2鼠脾細胞（刺激細胞）在20ml培養液中混合，置37℃，5%CO2溫箱培養0～4d，作為原代MLC。離心收集原代MLC細胞，用培養液洗次。取6×06 原代細胞與2.5×07 經過照射的脾細胞混合，同上述條件培養36h，收集培養上清，置-70℃保存備用。細胞作為以下試驗用的繼發MLC細胞。

 

③ EL-4上清的製備：於24孔板加入06 /ml EL-4鼠淋巴瘤細胞和20ng PMA，培養4h。收集細胞，以培養液洗3次，加入培養液後繼續培養36h。收集上清，置-70℃保存備用。

 

操作步驟

 

. 於96孔培養板孔中加入06 /00μl經過照射的同種脾細胞。

 

2. 取繼發MLC細胞，用含ConA或MLC上清的培養液作有限稀釋至～0個細胞/ml，於步驟（）板孔中加入50μl細胞懸液。培養4d後各孔加入50μl ConA或MLC上清和50μl培養液。繼續培養7～0d。

 

3. 用5Cr釋放試驗測定細胞毒活性，以篩選同種反應CTL與Th。若細胞毒試驗陰性，可以增殖試驗測定Th活性。亦可通過IL-2、IL-4的產生或CD4、CD8的表達進行篩選。

 

4. 鑒定同種反應性T細胞的特征，如細胞毒活性、增殖反應或某些淋巴因子的分泌等。

 

5. 克隆細胞的維持:將2.5×04 ～×05 細胞轉種24孔培養板孔中，同時加入×06 經過照射的同種脾細胞和含條件液的培養液，每周傳代一次。