總RNA提取實驗

總RNA提取可以：（）獲得高純度、高質量的總RNA；（2）可以滿足生物學下遊實驗NorthernBlot、核酸酶保護實驗、RT-PCR、qRT-PCR 和陣列分析所需。
實驗方法原理 總RNA 提取試劑盒，可以用來製備高質量的可用於(yu) 建庫的RNA 。該總RNA 純化係統采用兩(liang) 種的RNA酶抑製劑，異硫氰酸弧（GTC）和β-巰基乙醇，加上整個(ge) 操作都在冰浴下進行，這樣就能顯著降低RNA 的降解速率。

GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯合使用，將促使核蛋白複合體(ti) 的解離，使RNA 與(yu) 蛋白質分離，並將RNA釋放到溶液中。而進一步從(cong) 複合體(ti) 中純化RNA ，則根據Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法進行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進入水相，這樣使其與(yu) 仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉澱濃縮。進一步將上述RNA沉澱複溶於(yu) GTC溶液中，接著用異丙醇進行二次沉澱，隨後用乙醇洗滌沉澱，即可去除所有殘留的蛋白質和無機鹽，而RNA 中如含無機鹽，則有可能對以後操作中的一些酶促反應產(chan) 生抑製。
實驗材料 微生物 動物細胞 植物組織
試劑、試劑盒 RNA 提取試劑盒 焦碳酸二乙酯 乙醇
儀(yi) 器、耗材 恒溫水浴 冷凍高速離心機 紫外分光光度計 取液器 電泳儀(yi) 電泳槽
 

實驗步驟 一、細胞或組織破碎

. 微生物材料

（）發酵3-4天（或對數生）的菌體(ti) ，離心收集菌絲(si) 體(ti) （動植物材料無需此步處理）。

（2）用經DEPC處理的水洗菌絲(si) 體(ti) 2-3次，並盡量除去殘存的水。

（3）加液氮充分研磨，使其成為(wei) 粉末，以釋放RNA。

（4）研磨後的樣品轉移至2 ml變性液的容器中勻漿。

2. 動植物細胞培養(yang) 材料 （適用的樣品量為(wei) 細胞：08）

（）細胞或組織培養(yang) ：按常規方法進行。

（2）深層懸浮培養(yang) 細胞的破碎。

①細胞收集：含一定濃度的細胞培養(yang) 液置於(yu) 無菌離心管中，4℃，3 000 g離心5分鍾。

②細胞洗滌：上步沉澱用25毫升滅菌後冰凍的×PBS緩衝(chong) 液洗滌，然後4℃，3 000 g離心5分鍾。

③細胞破碎：在沉澱細胞中加入5 ml預冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿。

3. 表麵培養(yang) 細胞的破碎

（）確定培養(yang) 瓶數量，使選定的各培養(yang) 瓶細胞累加後總量達08。

（2）細胞收集：將培養(yang) 液倒掉，用預冷的無菌PBS緩衝(chong) 液洗滌一次，在培養(yang) 瓶中加入8 ml預冷變性液，轉動培養(yang) 瓶，使細胞溶解，此時可見粘度加大。

（3）用無菌吸管將*個(ge) 培養(yang) 瓶中的液體(ti) 吸入第二個(ge) 培養(yang) 瓶，旋轉，溶解細胞，再吸入第三個(ge) 培養(yang) 瓶，以此類推，直到將所選定的培養(yang) 瓶全部洗滌一次，然後從(cong) *個(ge) 培養(yang) 瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yang) 瓶洗一次。

（4）將上述2 ml含細胞的變性液轉移至一50毫升無菌離心管中，勻漿破碎細胞。

3. 植物組織破碎 （適用的樣品量為(wei) 0.05 g組織）

（）將600 ul變性液置於(yu) .5 ml離心管中，將此離心管放於(yu) 冰浴中5分鍾。

（2）將0.05 g新鮮組織用液氮冰凍。

（3）在液氮下，研磨組織塊。

（4）待液氮揮發後，將上述分散的組織轉移至無菌離心管中。

4. 動物組織破碎 （適用的樣品量為(wei) g 組織）

（）將2 ml變性液置於(yu) 50 ml離心管中，將此離心管放於(yu) 冰浴中5分鍾。

（2）在上述管中加入 g新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎。

二、RNA 的抽提

（） 在經變性液勻漿的細胞或組織600 ul＋60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉*混勻，可用漩渦振蕩器。

（2）600 ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\），*混勻或漩渦振蕩器振蕩0秒。

（3）冰裕中0-5分鍾，離心，4℃，0 000 g，20分鍾。

（4）上層水相吸至無菌離心管中+等體(ti) 積的異丙醇，-70℃，30分鍾沉澱RNA。

（5）離心4℃，0 000g，20分鍾。

（6）沉澱RNA ，冷凍幹燥5分鍾 ， RNA 沉澱重新溶於(yu) 300 ul變性液中，可振蕩（有時為(wei) 了幫助溶解，可在65℃加熱，但時間應極短）。

（7） 60 ul pH4.0的2M乙酸鈉*混勻，可用漩渦振蕩器。

（8） 600 ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\），*混勻或漩渦振蕩器振蕩0秒。

（9） 冰裕中0-5分鍾，離心，4℃，0 000 g，20分鍾。

（0）上層水相吸至無菌離心管中。

（） 等體(ti) 積異丙醇二次沉澱（-70℃，30分鍾），75%乙醇洗沉澱，沉澱冷凍幹燥，複溶於(yu) 去RNA 酶的水中（對於(yu) 準備保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為(wei) 0.25 M，再加入2.5體(ti) 積的乙醇，-70℃保存。）。